ACAD
03 Figura 1

ANÁLISIS MOLECULAR DE LA MICROBIOTA DUODENAL DE NIÑOS Y ADULTOS CON Y SIN ENFERMEDAD CELIACA

Esther Nistal1, Jenifer Pérez-Andrés1, Alexandra R Herrán1, Alberto Caminero4, Santiago Vivas3, José M Ruiz de Morales2, Ricardo Vicente Ullan6, y Javier Casqueiro 1,

Área de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas y Ambientales, Universidad de León. Departamento de Inmunología y Gastroenterología, Hospital de León. Instituto de Biología Molecular, Genómica y Proteómica (INBIOMIC), e Instituto de Biomedicina (IBIOMED) Campus de Vegazana, Universidad de León. Instituto de Biotecnología de León. León.

 

 

RESUMEN

El gluten, un componente muy común en la dieta humana, es capaz de activar la patogénesis de la enfermedad celiaca en individuos genéticamente predispuestos. Aunque se conoce muy bien la función de las enzimas digestivas humanas sobre las proteínas del gluten, existe un gran desconocimiento sobre el papel que lleva a cabo la microbiota intestinal en el metabolismo del mismo. El objetivo de este estudio fue analizar molecularmente mediante PCR-DGGE la microbiota duodenal que participa en el metabolismo del gluten. Para ello se cultivaron biopsias duodenales de niños y adultos en un medio de cultivo (MCB) que contenía gluten como única fuente de nitrógeno.

El análisis mediante PCR-DGGE mostró que la microbiota duodenal capaz de crecer en MCB está dominada por Streptococcus salivarius y S. oralis. Sin embargo, también se detectaron otros géneros como Lactobacillus, Gemella, Haemophilus, Clostridium, Granulicatella y Staphylococcus, aunque con una frecuencia más baja. Por tanto, aunque no se pudo asociar ningún perfil electroforético a la enfermedad, sí que se ha observado una gran diversidad de bacterias duodenales que podrían estar involucradas en el metabolismo del gluten. Son necesarios más estudios que permitan caracterizar en detalle la microbiota duodenal asociada al metabolismo de gluten, con el fin de plantear en un futuro posibles alternativas terapéuticas.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad celiaca (EC) es una enteropatía inflamatoria crónica del intestino delgado que aparece en individuos genéticamente susceptibles y es causada por una respuesta inmune inapropiada a las proteínas del gluten (1, 2). Actualmente, el único tratamiento efectivo para la EC es la eliminación total del gluten de la dieta durante toda la vida del paciente (3).

El gluten está formado principalmente por proteínas, las cuales son resistentes a la digestión completa por las enzimas digestivas humanas debido a su alto contenido en prolina y glutamina. Como consecuencia de esta digestión parcial, se originan péptidos de gran tamaño que aparecen en el lumen intestinal, los cuales generan una respuesta inmune inadecuada en pacientes con EC (4). Estudios recientes han mostrado que la microbiota intestinal desarrolla una intensa actividad metabólica en el organismo humano, actuando en la digestión de componentes de la dieta, como polisacáridos complejos y, en menor medida, proteínas, entre las que se incluye el gluten (5). Sin embargo, hay un conocimiento escaso sobre el papel que llevan a cabo los microorganismos en el metabolismo del gluten. Estudios recientes han mostrado que la microbiota intestinal puede ejercer un papel fundamental en la digestión de las proteínas del gluten y de los péptidos derivados. Aunque se considera que la digestión de los compuestos proteicos comienza en el estómago, se ha descrito una actividad proteolítica de origen bacteriano en la cavidad oral. Esta actividad es capaz de hidrolizar péptidos ricos en prolina como los que aparecen en las proteínas del gluten (6). Dentro de las bacterias orales que generan esta actividad se han identificado Rothia mucilaginosa y R. aeria, las cuales son capaces de digerir eficientemente estas proteínas (7). Curiosamente, especies de Rothia han sido también descritas en el duodeno (8). Otras bacterias relacionadas con el metabolismo del gluten en la cavidad oral son Streptococcus mitisS. pneumoniaeStaphylococcus epidermidis, Bifidobacterium longum y B. dentium (7). A esta idea se suma un estudio realizado por nuestro grupo, que ha descrito una actividad glutenásica fecal (AGF) relacionada directamente con la ingesta de gluten; dicha actividad podría ser derivada del metabolismo microbiano en el intestino (5). Otros estudios muestran que cepas de Bifidobacterium y Bacteroides fragilis, aisladas de las heces humanas, son capaces de digerir péptidos derivados del gluten (9, 10). Caminero et al (11)mostraron una amplia variedad de microorganismos pertenecientes a la microbiota fecal capaces de utilizar el gluten como nutriente, lo que apunta claramente a la gran importancia de la microbiota en el metabolismo del gluten. En consecuencia de este hecho y de acuerdo con las nuevas evidencias que señalan a una posible contribución bacteriana en el desarrollo de la EC (12, 13, 14, 15), nos planteamos estudiar molecularmente, mediante PCR-DGGE, la microbiota duodenal que participa en el metabolismo del gluten a partir del cultivo de biopsias de niños y adultos en un medio que contiene gluten como única fuente de nitrógeno.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes y Muestras duodenales

Se recogieron biopsias duodenales de forma consecutiva de niños (rango de edad 1-12 años) y adultos (rango de edad entre 15-40 años) procedentes de los Servicios de Gastroenterología de adultos y pediátrica del Hospital de León que acudieron a la consulta con síntomas. 24 sujetos fueron incluidos en este estudio: 8 individuos adultos no enfermos celiacos (No-ECA) (4 hombres y 4 mujeres), 3 pacientes adultos enfermos celiacos activos (ECAA) (2 hombres y 1 mujer), 5 adultos enfermos celiacos tratados (ECTA) (2 mujeres y 3 hombres), 2 niños no enfermos celiacos (No-ECN) (1 niño y 1 niña) y 6 niños enfermos celiacos activos (ECAN) (4 niños y 2 niñas). Al diagnóstico, todos los pacientes celiacos presentaban datos clínicos compatibles con la enfermedad, como serología positiva (anticuerpos transglutaminasa), genética positiva (HLA-DQ2-DQ8), y alteraciones histológicas en la mucosa de la biopsia duodenal. Las muestras de los pacientes ECA fueron recogidas en el momento del diagnóstico antes de comenzar la dieta sin gluten. Los pacientes ECT en el momento de la toma de la biopsia llevaban más de un año en dieta sin gluten. En el caso de los individuos No-EC, las muestras de biopsias duodenales fueron obtenidas de pacientes que fueron referidos a las consultas de gastroenterología debido a otras patologías intestinales (diarrea crónica, hernia de hiato, etc.). Ninguno de los individuos incluidos en el estudio fue tratado con antibióticos durante al menos un mes antes de la toma de las muestras. Las biopsias fueron recogidas mediante pinza de biopsia convencional a través del canal de trabajo de un videogastrocopio. En el caso de los niños se utilizó un fibrogastroscopio pediátrico con una pinza de menor tamaño adaptada para el canal de trabajo. En los niños se utilizó siempre sedación profunda que practicó un pediatra entrenado en la UCI pediátrica. En los adultos se ofrecía sedación profunda con propofol que controlaba el propio endoscopista que tomaba la biopsia. En total se tomaban 2 biopsias en los adultos y 3 en los niños de la segunda y tercera porción duodenal. Estas biopsias eran las primeras en tomarse, antes de las enviadas para anatomía patológica, y evitar así contaminaciones. Según eran tomadas las biopsias, se inoculaba directamente en un tubo de ensayo con 1 cc de suero salino. Estas muestras eran procesadas de forma inmediata a temperatura ambiente. En todos los casos se obtuvo el consentimiento informado tanto de los padres de los niños, como de los pacientes adultos incluidos en el estudio a la toma de muestras. Los protocolos de estudio fueron aprobados por la comisión de ética del Hospital de León. Todas las muestras fueron extraídas mediante endoscopia alta con biopsia de la 2ª-3ª porción duodenal y fueron procesadas de inmediato.

Medio de cultivo y condiciones de cultivo

Para el aislamiento de los microorganismos a partir del cultivo de biopsias se empleó el medio líquido MCB diseñado en nuestro laboratorio que contiene gluten como única fuente de nitrógeno: CaCl2 2mM, ZnSO4 2mM, Glucosa 2%, Tween 80 0.1% (v/v), FeCl3 20µM, Gluten (Sigma-Aldrich) 3%, y digerido de gluten con pepsina 0.5%. El pH fue ajustado a 6,5 con un tampón fosfato (1%). El medio se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a 121ºC. Seguidamente mediante cultivo en placa se comprobó que el medio estaba totalmente estéril.

El digerido de gluten al 3% (100 mL) se obtuvo al incubar 3 g de gluten con 1 g de pepsina a pH 2 ajustado con HCl (10M). La mezcla se incubó durante 2 horas a 37ºC con agitación (250 rpm). Seguidamente se elevó el pH a 6,5 con NaOH (1M) y posteriormente se esterilizó a 121ºC en el autoclave durante 20 minutos.

La biopsia se inoculó en un matraz con 10 mL de medio de cultivo y se incubó durante 48 horas a 37ºC con agitación (100 rpm) en condiciones microóxicas.

Extracción de ADN de los cultivos 
de biopsia y amplificación por PCR

Las extracciones de ADN genómico de los cultivos de biopsia se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del protocolo del kit SpeedTools Tissue DNA Extraction (Biotools, España). La concentración de ADN fue determinada empleando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Saveen&Werner, Limhann, Suecia).

Para caracterizar molecularmente la microbiota duodenal se amplificó mediante PCR dos regiones variables de diferente tamaño del ADN ribosomal 16S y así poder comparar los resultados obtenidos con ambos fragmentos. Para la amplificación de los genes del ARNr 16S ello se empleóaron dos parejas de cebadores. la pareja de oligonucleótidos HDA1GC y HDA2 (16) que amplifican un fragmento de unos 200 pb correspondientes a la región V3 del ADNr 16S y la pareja de cebadores F968GC y R1401 (17) que amplifican un fragmento de aproximadamente 450 pb de la región V6-V8 del ADNr 16S. Para dichas amplificaciones se usó el kit comercial iProof High-Fidelity Master Mix (BioRad). El programa de PCR que se utilizó para este kit consistió en una desnaturalización inicial de 98ºC durante 30 segundos y a partir de aquí 30 ciclos con las siguientes temperaturas: 98ºC durante 10 segundos, 56ºC ó 55ºC durante 30 segundos y 72ºC, 30 segundos. El programa de PCR finalizó con una extensión a 72ºC durante 10 minutos.

Análisis de la microbiota obtenida a partir del cultivo de biopsias duodenales mediante electroforesis en gradiente desnaturalizante (DGGE)

Los productos de PCR de la región V3 y V6-V8 del ADNr 16S fueron separados mediante la técnica del DGGE en geles del 10% y 8% de acrilamida/bisacrilamida en un gradiente desnaturalizante de urea (7M) y formamida (40% v/v) del 35-55% y 40-60% respectivamente. El análisis de DGGE de los productos de PCR se realizó en el aparato DCode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad, Richmond, CA), a un voltaje constante de 70 V y una temperatura de 60ºC durante 15 horas. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio durante 30 minutos y visualizados bajo un transiluminador con luz ultravioleta. Las bandas de interés fueron cortadas del gel de poliacrilamida con un cubre estéril bajo luz ultravioleta e incubadas en 20 µL de agua milliQ estéril a 4ºC durante toda la noche. Alícuotas de 5 µL fueron empleadas como molde en una nueva reacción de PCR. Se llevó a cabo la reamplificación de la región ribosomal con el par de oligonucleótidos correspondiente pero sin portar la cola de poli-GC. Los fragmentos reamplificados fueron purificados y clonados con el sistema StrataClone PCR Cloning (Stratagene, La Jolla, CA) para posteriormente ser secuenciados en el Servicio de secuenciación de la Universidad de León y estas se compararon con las secuencias depositadas en la base de datos de GeneBank con el algoritmo del BLASTn. Para completar la identificación molecular de estas secuencias, se llevó a cabo un análisis filogenético. Las secuencias con un porcentaje ≥ 97% de identidad con respecto a las secuencias de bacterias conocidas después del análisis filogenético fueron consideradas de la misma especie.

Análisis estadístico

Las diferencias en número de especies entre los distintos grupos de poblaciones fueron analizadas empleando el test “chi-cuadrado” (se aplicó la corrección de Yates). La significación estadística fue establecida para valores de p<0.05.

RESULTADOS

Análisis molecular mediante PCR-DGGE 
de la región V3 del ADNr 16S

En la Figura 1 se observan los perfiles de DGGE obtenidos a partir de los productos de PCR de la región V3 empleando como molde el ADN de los cultivos de biopsias duodenales. Los diferentes perfiles mostraron entre 1 a 5 bandas intensas y bien resueltas. El resto de las bandas eran tenues o daban lugar a un smear. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en cuanto al número de bandas entre los perfiles electroforéticos de individuos sanos y de enfermos celiacos, tanto activos como tratados, ni tampoco se apreciaron diferencias asociadas a la edad.

Se seleccionaron varias bandas para llevar a cabo su identificación molecular. Los productos de PCR que fueron identificados por secuenciación a partir de las bandas del DGGE aparecen en la Tabla I. Para completar la identificación molecular de cada una de las bandas secuenciadas se llevó a cabo un análisis filogenético. La frecuencia de las diferentes especies detectadas mediante PCR-DGGE se muestra en la Tabla II. Dentro de las diferentes especies identificadas, predominó Streptococcus salivarius y S. oralis que se detectaron en prácticamente todos los individuos, tanto niños como adultos independientemente de la enfermedad. Por el contrario, Bacillus cereus, Haemophilus influenza, Lactobacillus mucosae y Staphylococcus epidermidis sólo fueron detectados a partir del cultivo de biopsias de niños, pero con una frecuencia muy baja. A partir del cultivo de biopsias procedentes de individuos adultos, también aparecieron con baja frecuencia especies como Clostridium perfringens, Granulicatella elegans o G. adiacens, Lactobacillus crispatus y L. gasseri.

Análisis molecular mediante PCR-DGGE de la región V6-V8 del ADNr 16S

Los productos de PCR generados por los cebadores F968GC/R1401 fueron separados mediante DGGE en geles del 8% de acrilamida/bisacrilamida en un gradiente desnaturalizante del 40-60% de urea y formamida. Como se observa en la Figura 2, los patrones de bandas de DGGE obtenidos con los cebadores universales correspondientes a la región V6-V8 del ADNr 16S, mostraron muy pocas bandas (entre 1 a 4 bandas), pero la gran mayoría estaban bien resueltas. No se pudo asociar ningún perfil electroforético a la enfermedad. Tampoco se observaron diferencias en cuanto a número de bandas presentes en los perfiles electroforéticos de niños y de adultos, ni entre sanos y enfermos.

A partir de los geles, se seleccionaron varias bandas para llevar a cabo su identificación molecular. Los productos de PCR que fueron identificados por secuenciación a partir de las bandas del DGGE aparecen en la Tabla III. La frecuencia de cada una de esas bandas se muestra en la Tabla IV. Los resultados fueron similares a los obtenidos con los cebadores que amplifican la región V3, ya que las especies identificadas fueron las mismas, con la aparición de algunas nuevas. De nuevo, los fragmentos amplificados correspondientes a las especies Streptococcus oralis y S. salivarius aparecieron en prácticamente todos los individuos sanos y enfermos, independientemente de la edad. Por el contrarioGranulicatella elegans o G. adiacens fue detectada en 4 de los 6 niños ECA y no aparece en ninguno de los niños sanos. El resto de las especies identificadas presentaban una frecuencia muy baja, ya que aparecían en tan solo una o dos de las biopsias analizadas (Tabla IV).

03 Figura 1

Figura 1.- Perfiles de DGGE de las comunidades de bacterias obtenidas a partir del cultivo en un medio con gluten de biopsias procedentes de niños no enfermos celiacos (No-ECN) (carriles 1 y 2), niños enfermos celiacos activos (ECAN) (carriles desde el 3 al 8), adultos no enfermos celiacos (No-ECA) (carriles del 9 al 16), adultos enfermos celiacos activos (ECAA) (carriles del 17 al 19) y adultos enfermos celiacos tratados (ECTA) (carriles del 20 al 24). Los cebadores empleados para llevar a cabo la reacción de PCR fueron HDA1GC/HDA2. Los números indican los fragmentos secuenciados, cuya identificación se muestra en la Tabla I

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03 Figura 2

Figura 2.- Perfiles de DGGE de las comunidades de bacterias obtenidas a partir del cultivo de biopsias en un medio con gluten de niños no enfermos
celiacos (No-ECN) (carriles 1 y 2), niños enfermos celiacos activos (ECAN) (carriles del 3 al 8), adultos no enfermos celiacos (No-ECA)
(carriles del 9 al 16), adultos enfermos celiacos activos (ECAA) (carriles del 17 al 19) y adultos enfermos celiacos tratados (ECTA) (carriles del
20 al 24). Los cebadores empleados para llevar a cabo la reacción de PCR fueron F968GC/R1401. Los números indican los fragmentos secuenciados,
cuya identificación se muestra en la Tabla III

 

01 tabla3

 

DISCUSIÓN

El conocimiento de las bacterias duodenales involucradas en el metabolismo del gluten es escaso. Es importante estudiar qué bacterias participan y cómo participan puesto que las proteínas del gluten son responsables de la activación de la patogénesis de la EC. Para el estudio de estas bacterias duodenales se ha empleado un medio de cultivo diseñado en nuestro laboratorio, el MCB, que lleva gluten como única fuente de nitrógeno, lo que va a permitir la proliferación de bacterias capaces de emplear las proteínas del gluten como nutriente. El análisis mediante PCR-DGGE mostró que la microbiota duodenal capaz de crecer en el MCB está dominada por Streptococcus salivarius y S. oralis, ya que fueron identificados en el 71% y 50% (respectivamente) de los cultivos de biopsias analizados. La predominancia del género Streptococcus en el duodeno ha sido reflejada previamente en varios trabajos que han empleado técnicas clásicas de cultivo para identificar la microbiota duodenal (18, 19). Además, estudios de caracterización de la microbiota intestinal involucrada en el metabolismo del gluten en la cavidad oral y el intestino grueso han mostrado la presencia de cepas de Streptococcus capaces de hidrolizar el gluten (11, 20, 21). Por tanto, estas bacterias duodenales podrían jugar un papel importante en el metabolismo del gluten, participando en la hidrólisis bacteriana de péptidos inmunogénicos del gluten en el intestino delgado. En los últimos años, varias bacterias capaces de digerir gluten han sido propuestas como posible tratamiento de la EC (21, 22); sin embargo ninguna de ellas es miembro hospedador de la microbiota duodenal, lo que dificulta su uso clínico. Así mismo, diferentes estudios han descrito que determinadas cepas de Streptococcus salivariuspueden ser empleadas como probióticos, ya que son capaces de inducir una respuesta anti-inflamatoria y ejercer un efecto protector frente a la apoptosis inducida por patógenos (23, 24).

Otros géneros como LactobacillusGemellaHaemophilusClostridiumGranulicatella y Staphylococcus también se detectan mediante PCR-DGGE, aunque con una frecuencia más baja. Lo que caracteriza a todos estos microorganismos, es que son capaces de crecer sobre un medio de cultivo que contiene el gluten como única fuente de nitrógeno. Esto puede ser explicado por diferentes razones; i) presentan actividad proteolítica frente al gluten; ii) por el contrario carecen de esa actividad, pero son capaces de crecer en ese medio gracias a los nutrientes que le aportan otros microorganismos que si son capaces de hidrolizar el gluten; iii) o su crecimiento se ve favorecido, porque son capaces de emplear los péptidos de menor tamaño que se originan como consecuencia de la digestión parcial del gluten con pepsina. Estudios previos han mostrado distintas cepas bacterianas de géneros como ClostridiumLactobacillus y Staphylococcus son capaces de hidrolizar gluten (11). Por tanto, estos microorganismos pueden tener un papel en el metabolismo del gluten en el duodeno.

Varios trabajos han mostrado una disbiosis intestinal en pacientes con EC (12-15). Sin embargo, los mecanismos mediante los cuales las bacterias pueden participar en la patogénesis se desconocen. Se ha mostrado que algunos de los grupos bacterianos alterados en la EC están relacionados con el metabolismo del gluten (11, 13, 14, 25, 26). Así mismo, Bernardo et al, (27) mostraron la existencia de un patrón específico de metaloproteasas bacterianas con capacidad de degradar gliadina en la mucosa duodenal de pacientes con EC diferente al patrón presente en los sanos. Nuestro trabajo teniendo en cuenta el número reducido de pacientes analizados de cada tipo, no muestra un perfil de especies bacterianas asociadas a la EC o a los individuos no enfermos celiacos. Quizás las diferencias podrían estar asociadas a la funcionalidad de las distintas cepas que son capaces de crecer en el medio MCB. Los enterotipos que determinan la microbiota intestinal, en la mayoría de los casos se definen por la composición de especies. Pero las funciones moleculares no siempre son llevadas a cabo por las especies más abundantes. Por ello resulta necesario llevar a cabo también un análisis funcional para poder entender el papel de las comunidades microbianas (28). Además, la técnica PCR-DGGE es capaz de detectar entre el 90-99% de las especies más representativas de una comunidad, sin discriminar entre células vivas, células muertas o células en un estado no cultivable. Sin embargo, esta técnica no refleja la presencia de otras especies de bacterias menos representativas que si pueden ser detectadas mediante colecciones de clones o mediante técnicas clásicas de cultivo (29, 30).

La baja diversidad bacteriana obtenida con el medio MCB puede deberse a las condiciones adversas que presenta el duodeno como por ejemplo pH ácido, peristaltismo o la presencia de ácidos biliares. Además, se ha utilizado un medio de cultivo de enriquecimiento con gluten, el cual se caracteriza por presentar secuencias peptídicas de difícil digestión. Por estos motivos, es posible que una parte de los microorganismos presentes en el duodeno no puedan crecer en el medio de cultivo MCB. Nistal et al, (8) mostraron que una parte importante de la microbiota duodenal de los adultos está formada por bacterias aún no cultivadas. A menudo, para el cultivo de microorganismos del tracto gastrointestinal se emplean medios de cultivo complejos (como por ejemplo Brain Heart Infusion broth, Brucella broth, etc.,) (31, 32) que se caracterizan por ser medios ricos en nutrientes ya que en su composición se incluyen hidrolizados de productos animales o vegetales, como caseína, carne, soja, extracto de levaduras u otras sustancias nutritivas que favorecen el crecimiento de muchos microorganismos. Sin embargo, el medio MCB carece de esos componentes, lo que hace que se trate de un medio de cultivo más exigente para el crecimiento de los microorganismos. Esto permite la proliferación y caracterización de bacterias que directa o indirectamente están involucradas en el metabolismo del gluten.

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RECONOCIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por un proyecto del Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigación Sanitaria cofinanciado por FEDER (FIS P110/02447) y por un proyecto de la Junta de Castilla y León, Consejería de Sanidad (Ref. 520/A/10). Esther Nistal y Alexandra Rodríguez recibieron una beca de la Junta de Castilla y León, cofinanciada por el Fondo Social Europeo. Jénifer Pérez-Andrés recibió una beca del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte del Gobierno de España

 

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CORRESPONDENCIA:

Esther Nistal
Área de Microbiología, 
Facultad de Ciencias Biológicas y Ambientales. 
Universidad de León. 
Telf: 987 291 504; 
esthernistal@hotmail.com

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INFECCIÓN POR CLOSTRIDIUM DIFFICILE

Carmen Martos Plasencia 1, Joaquín Rodríguez Sánchez 1, María Adán Alonso 1, Melvyn Peña Gómez 1, Rosario Salmoral Luque 1, José Olmedo Camacho1

1Sección de Aparato Digestivo. Hospital General Universitario de Ciudad Real.

 

 

 

RESUMEN

Introducción. La diarrea por clostridium difficile (C. difficile) supone la causa más frecuente de diarrea hospitalaria en occidente. El amplio uso de antibióticos y el envejecimiento de la población han supuesto los factores más determinantes en el aumento de su incidencia en los últimos años . Los cambios en la epidemiología y el desarrollo de nuevos agentes farmacológicos para su tratamiento, han despertado el interés en la realización de una revisión de la literatura más reciente acerca de la enfermedad.

Materiales y métodos. La revisión se ha llevado a cabo consultando las principales guías de consenso americanas y europeas de diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. Para ella se ha realizado también una búsqueda bibliográfica de artículos publicados en la base de datos Pubmed entre los años 1994 y 2014.

Conclusión. La colitis pseudomembranosa es una infección cada vez más incidente. El diagnostico está basado principalmente en la clínica y algoritmos que combinan enzimo-inmunoensayo (ELISA) de GDH y toxinas de C. Difficile. Aunque en los últimos cuatro años se han desarrollado nuevos agentes farmacológicos para su tratamiento como la fidaxomicina, los esquemas de tratamiento continúan centrados en el tratamiento clásico con metronidazol y vancomicin. Debemos intensificar nuestro esfuerzo en la prevención primaria y secundaria de la enfermedad con políticas de uso responsable de antibióticos y establecer medidas para evitar la propagación por contacto de la infección.

PALABRAS CLAVE

Diarrea, antibiótico, Clostridium difficile, colitis pseudomembranosa, metronidazol, vancomicina.

ABREVIATURAS

C. difficile: Clostridium Difficile. IBP: inhibidores de la bomba de protones, AntiH2: antagonistas del receptor H2, IDSA: Sociedad Americana de enfermedades infecciosas , ACG: Colegio Americano de Gastroenterología, ELISA: enzimo-inmunoensayo

INTRODUCCIÓN

La diarrea por C. difficile supone la causa más frecuente de diarrea hospitalaria en países occidentales (1). Es el responsable del 15- 25% de las diarreas que se producen en pacientes consumidores de antibióticos. Su incidencia está estimada entre 3,4–8,4 casos por pacientes hospitalizados en una unidad de agudos. No existen datos concretos acerca de la incidencia de la enfermedad en Hospitales de cuidados intermedios y crónicos pero la edad de los pacientes de estos centros y el consumo antibiótico ampliamente extendido permite prever una incidencia mayor en este medio.(2)

La mortalidad de la enfermedad ronda el 2% de los pacientes que contraen la infección por el bacilo (2). A pesar de contar con datos bajos de mortalidad, la infección por C. difficile supone un aumento en la morbilidad de los pacientes, generando un aumento de los costes directos derivados del tratamiento de la enfermedad que en el año 2008 llegó a calcularse en 4,8 billones de dólares en EEUU. (3)

EPIDEMIOLOGÍA

En los últimos 10 años, se ha producido un aumento de la incidencia de la infección. Entre 2000 y 2005 se documentó este aumento en hospitales estadounidenses y en la región canadiense de Quebec que posteriormente se ha extendido a países europeos. Este incremento está relacionado a la diseminación de la cepa 027/B1/ NAP1. Esta cepa posee mayor virulencia que las conocidas previamente y un espectro de resistencia a quinolonas superior. Aunque se trata de una cepa de alta virulencia, afortunadamente, no se encuentra entre las que producen la enfermedad con más frecuencia. En un estudio multicéntrico publicado en 2009, se definieron los ribotipos más frecuentes siendo éstos el 241, 126 y 078 (4).

FACTORES DE RIESGO

Los factores de riesgo de adquisición de la enfermedad son múltiples pero podemos destacar entre los más importantes los siguientes:

• Consumo de antibióticos

El consumo de antibióticos es el principal y más importante factor de riesgo para el desarrollo de una colitis pseudomembranosa. En ausencia de la flora saprófita, las esporas eclosionadas en el colon pueden crecer sin competencia biológica. Los grupos de fármacos especialmente relacionados con la enfermedad son penicilinas, cefalosporinas, quinolonas y clindamicina.(5) Un 96% de los pacientes que presentan infección sintomática por C. difficile han recibido antibióticos en los 14 días previos a la aparición de diarrea.(6)

• Edad

Existe un mayor riesgo de enfermedad en los mayores de 45 años ; los pacientes mayores de 65 años son los que presentan un riesgo de enfermedad grave más significativo. En estos grupos poblacionales la infección ha experimentado un aumento de la incidencia. (1)

• Hospitalización o institucionalización

Los antibióticos son tratamientos de uso frecuente en los pacientes ingresados. Este hecho junto con la agregación de pacientes, favorece la trasmisión durante los cuidados y exploraciones generando un aumento del riesgo de adquisición de la enfermedad comparativamente con pacientes que presentan diarrea en la comunidad. (7)

• Consumo de inhibidores de la bomba de protones (IBPs)

Existe controversia acerca del papel de la inhibición de la secreción gástrica sobre la infección por CD. En la literatura se han encontrado estudios que se posicionan a favor de la relación de la enfermedad con el consumo de antagonistas del receptor H2 (antiH2) como con IBP (8,9). La relación entre la infección y la supresión, posteriormente fue puesta en duda por cuestiones de la metodología de los estudios o por aparición de factores de confusión (5). En un metanálasis publicado en el año 2012 se demuestra un aumento de la incidencia de diarrea por CD del 65% (OR 1.69 (95% IC 1.39-1.97) p < 0.001.) en los pacientes tratados con IBPs. (10)

• Inmunosupresión: trasplantes, pacientes oncológicos, tratamiento biológico

Actualmente el número de pacientes sometidos a terapia inmunosupresora o quimioterapia hace que la inmunodepresión sea una circunstancia frecuente en la práctica clínica. Estos pacientes presentan mayor facilidad para la adquisición de infecciones comunes y oportunistas derivadas de su propia situación de neutropenia o linfopenia. La situación de inmunosupresión contribuye por sí misma al aumento del riesgo de infección por C. difficile y se combina con el alto consumo de antibióticos de estos pacientes para el tratamiento de las múltiples infecciones que sufren. (7)

• Cirugía abdominal

La manipulación del tracto gastrointestinal así como su exposición a agentes externos en las intervenciones quirúrgicas está relacionado con la aparición de diarrea por CD (11). En paciente con megacolon tóxico portadores de ileostomía está descrita la recurrencia de la infección tras la cirugía (12).

FISIOPATOLOGÍA

En 1978 el C.D fue descrito como el agente causal de la colitis pseudomembranosa. Es un bacilo gram positivo esporulado anaerobio estricto productor de dos toxinas. La toxina A entero tóxica y la toxina B citotóxica, siendo la B la que presenta un papel más importante en la virulencia del Clostridium. La transmisión de la infección se produce fundamentalmente por vía fecal oral. Tras un periodo de incubación de 2-3 días después del contagio se produce una germinación de las esporas ingestas a nivel intestinal. Los bacilos germinados en un ambiente favorecido por la disminución de la flora saprófita van a experimentar un fenómeno de sobrecrecimiento y formación de toxina que actúe sobre el epitelio intestinal produciendo una disrupción de éste, responsable de la clínica de la enfermedad. (2, 4, 13)

MANIFESTACIONES CLÍNICAS

El espectro clínico de la enfermedad es muy amplio. Desde pacientes asintomáticos o con clínica leve, que puede llegar a pasar desapercibida, hasta pacientes con gran repercusión sistémica en los que la infección puede llegar a producir la muerte.

La clínica puede dividirse en síntomas generales presentes en una infección por cualquier germen: afectación del estado general, astenia, debilidad y fiebre y otros síntomas propios de la afectación del tracto gastrointestinal.

La manifestación intestinal más típica es la diarrea, que es de características inflamatoria. El paciente puede llegar a producir mucosidad y sangre con las heces. Sin embargo la hematoquecia o melenas son muy infrecuentes (2). Aunque la diarrea sea frecuente en esta infección, puede no manifestarse. En ocasiones encontramos pacientes con formas graves con íleo o megacolon tóxico que presentaron mínima diarrea o no la presentaron.(2, 13, 14)

El dolor abdominal también es una manifestación frecuente de la enfermedad. Se trata de un dolor abdominal generalizado o localizado en mesogastrio, de curso cólico, producido por la distensión e hipermotilidad de las asas intestinales. Este puede llegar a ser de intensidad elevada en los pacientes que presentan megacolon o sufren una perforación intestinal.

Las náuseas y vómitos pueden acompañar al resto de síntomas generales especialmente en las formas de gravedad moderada o graves con afectación del estado general.

La severidad de la clínica que presentan los pacientes va a ser determinante a la hora de seleccionar el tratamiento que vamos a emplear. Las guías clínicas determinan la gravedad de la enfermedad en función del estado inflamatorio y la existencia de deterioro de la función renal (2,15-17).

Las formas leves o moderadamente graves presentan cifras de leucocitos menores o iguales a 15.000 u/mm3 con niveles de creatinina menores a 1,5 veces el valor basal del paciente.

En las formas graves, podremos observar en la analítica una leucocitosis mayor de 15000 u/mm3 con un deterioro de la función renal que suponga una creatinina en suero mayor de 1,5 veces el valor basal del paciente.

Cuando las formas graves se complican en forma de íleo, megacolon o perforación intestinal el paciente presenta inestabilidad hemodinámica y shock séptico. En 2013 el Colegio Americano de Gastroenterología describe en su guía de práctica clínica las formas graves y complicadas como aquellas en las que aparece: fiebre mayor de 38ºC, hipotensión, distensión abdominal, hipoalbuminemia (albúmina < 3 g/dl), leucocitosis mayor de 35.000 u/mm3, deterioro del estado neurológico, láctico > 2 mmol/l y signos de fallo multiorgánico (16).

TIPOS

Las guías de práctica clínica americanas (2,16) para el manejo clínico de la infección por C. difficile clasifican la enfermedad en tres tipos en función de criterios epidemiológicos de adquisición.

Diarrea por C. difficile de inicio hospitalario la clínica comienza en el contexto de una estancia hospitalaria tras un periodo mayor de 48 horas.

Diarrea de inicio en la comunidad asociada a instalación sanitaria el paciente ha estado ingresado en una institución sanitaria en las últimas 4 semanas.

Diarrea de inicio en la comunidad asociada a la comunidad no se documenta una estancia hospitalaria en más de 12 semanas previas al inicio de la clínica.

Diarrea por C. difficile indeterminada existe un periodo comprendido entre 4-12 semanas en el que el paciente estuvo en un medio hospitalario.

DIAGNÓSTICO

Se define la infección por C. difficile como un cuadro de diarrea (con 3 ó más deposiciones de heces no formadas en 24 horas) junto con una prueba de heces con resultado positivo para C.difficile toxinogénico, sus toxinas o hallazgos histológicos o endoscópicos compatibles con colitis pseudomembranosa.(2)

El diagnóstico de la colitis pseudomembranosa puede llegar a ser complejo. Para llegar a él es necesario junto con la clínica y las pruebas complementarias una buena anamnesis que nos despierte la sospecha de la enfermedad.

ESTUDIOS COMPLEMEMENTARIOS

LABORATORIO

Actualmente disponemos de varios estudios analíticos para el diagnóstico de confirmación de la diarrea por C. difficile. Los análisis de laboratorio para diagnóstico de C. difficile sólo deben ser llevados a cabo en pacientes sintomáticos.(2,16,17)

Clasicamente, se describe como técnica de referencia el cultivo intracelular y cultivo toxinogénico (2,16,17). El cultivo de heces combinado con el cultivo toxinogénico supone la prueba gold estándar desde el punto de vista epidemiológico para el diagnóstico de la infección (2). El cultivo de heces por sí solo no permite la distinción entre cepas toxinogénicas y no toxinogénicas. Además, sólo deberá realizarse asociado al test de detección de toxina de C. difficile (2,4,16). Estas técnicas a pesar de tener alta sensibilidad y especificidad (sensibilidad > 90% y especificidad > 95%) (4) presentan un largo tiempo de incubación. Por este motivo, en la práctica clínica habitual han sido sustituidos por otras técnicas de diagnóstico indirecto (2,4,16).

Dentro de las técnicas indirectas de diagnóstico contamos principalmente con 2 tipos de determinaciones de enzimo-inmunoensayo (ELISA). Estas técnicas se llevan a cabo en poco tiempo y alcanzan de forma aislada y combinada niveles de sensibilidad y especificidad equiparables al cultivo (4). La técnica más ampliamente extendida es la detección de toxina A y B de C. difficile. El principal problema de esta técnica reside en su sensibilidad (50-85%). Su baja sensibilidad diagnóstica ha justificado la elaboración de algoritmos diagnósticos combinados con la detección de glutamato deshidrogenasa (GDH) de la bacteria (2,4,17).

Los algoritmos diagnósticos de detección combinada establecen el diagnóstico cuando se obtiene un resultado positivo en las determinaciones de GDH y toxina. Cuando la GDH es positiva y la toxina negativa deberá realizarse un tercer test de confirmación. Habitualmente, el test de confirmación suele ser el cultivo con estudio de toxicidad o una técnica molecular para diagnóstico del clostridium (4,16,17).

En el caso de obtener una determinación negativa para GDH con una toxina positiva también precisaremos un test de confirmación. El resultado negativo de los dos test del algoritmo excluye el diagnostico microbiológico de la enfermedad (4, 17).

En los últimos años se han propuesto diferentes técnicas diagnósticas basadas en la detección de ácidos nucleicos de C. difficile (4) Dentro de este grupo de técnicas, la más extendida es la reacción de cadena polimerasa (PCR) para genes de la bacteria (2,4,16,17). La PCR ofrece una alternativa, sensible(> 90%), específica (> 97%) y rápida para el diagnóstico de la enfermedad.(4) Sin embargo, el elevado precio de la técnica y la ausencia de su disponibilidad en todos los centros hacen que no sea una técnica habitualmente utilizada en la práctica clínica.(2,4,16,17)

La realización de los test diagnósticos en pacientes asintomáticos o su repetición tras el tratamiento no está justificada. Así como no está indicado el tratamiento de portadores asintomáticos.(2,16,17)

ESTUDIOS RADIOLÓGICOS

Los estudios de imagen no son necesarios para establecer el diagnóstico de la enfermedad, sin embargo, pueden ayudarnos a diagnosticar las complicaciones secundarias como el ileo paralítico, ascitis, megacolon o perforación intestinal. Ante la sospecha de una de estas complicaciones debe realizarse un TAC abdomino-pélvico. En un paciente con una forma complicada de la enfermedad e indicación quirúrgica, la cirugía no debe ser retrasada por la realización de una prueba de imagen. (2,16)

ENDOSCOPIA

Los estudios endoscópicos no están indicados como una técnica diagnóstica a realizar de inicio en esta enfermedad. Recurriremos a ella en las formas graves, atípicas o diarreas persistentes en los que los datos de laboratorio y análisis microbiológicos no presenten datos concluyentes que orienten y/o confirmen el diagnóstico.(2)

Los hallazgos endoscópicos consisten en placas blanco-amarillentas que se distribuyen de manera irregular a lo largo de la mucosa colónica. El hallazgo endoscópico de pseudomembranas confirma el diagnóstico de colitis pseudomembranosa. Sin embargo, estos hallazgos sólo se visualizan en el 51-55% de los pacientes diagnosticados de diarrea porC.difficile, especialmente, en las formas más graves. Por este motivo, una colonoscopia negativa no excluye el diagnóstico. (2,4)

La principal entidad con la que se debe hacer el diagnóstico diferencial ante unos hallazgos endoscópicos compatibles con colitis pseudomembranosa, es la colitis isquémica, las características del paciente y sus antecedentes personales permiten orientar el diagnóstico de forma sencilla. (4)

Indicaciones de endoscopia:

• Casos graves de rápida evolución.

• Retraso de los resultados de los test de laboratorio.

• Test de laboratorio negativos y clínica persistente.

• Formas atípicas de la enfermedad (ausencia de diarrea, no consumo de antibióticos…).

TRATAMIENTO

Las medidas generales que se aplican en el soporte de un paciente con diarrea no van a diferir de las medidas que aplicaremos en una diarrea por C.difficile. En cuanto a las medidas específicas, la primera a llevar a cabo es la retirada del agente antibiótico que favorece el crecimiento de la bacteria. En las formas leves, esta intervención junto con el soporte general puede ser suficiente para la resolución del cuadro. (2,4,16,18)

En ocasiones se ha propuesto el uso de fármacos probióticos para el tratamiento de las infecciones del tracto gastrointestinal, en el tratamiento de la diarrea por C.difficile no existe suficiente evidencia que apoye su uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad y/o su recurrencia.(2,16,18)

El uso de antiperistálticos ha sido valorado en las guías de tratamiento más importantes, en todas ellas se recomienda evitar su utilización en paciente con diarrea por C.difficile. (2,16,18)

El tratamiento antibiótico en la diarrea por C.difficile se ha basado clásicamente en esquemas a partir de metronidazol o vancomicina (2,4,16, 18). En el año 2011 la FDA aprobó la utilización de la fidaxomicina (16). Un antibiótico macrocíclico no absorbible con actividad bactericida mediante la inhibición de la ARN polimerasa de C.diffile (4,19,20). Sin embargo, aunque ha demostrado no ser inferior a los tratamientos clásicos y mayor efectividad en la recurrencia no ha alcanzado un grado de recomendación equiparable al del tratamiento clásico (4,16,18).

TRATAMIENTO ANTIBIÓTICO DEL PRIMER EPISODIO

1. Formas leves y leve-moderada:

En las formas leves de la diarrea por C.difficile puede ser suficiente con la retirada del antibiótico responsable. En estos casos, se recomienda una observación clínica estrecha durante 48 horas. Si tras 48 horas persiste la clínica deberá iniciarse tratamiento con metronidazol 500 mg vía oral cada 8 horas durante 10- 14 días (2,16,18).

Los pacientes con clínica de gravedad moderada recibirán tratamiento con metronidazol 500 mg cada 8 horas vía oral durante 10-14 días desde el diagnóstico. Como alternativa al metronidazol en pacientes con intolerancia, embarazadas o durante la lactancia utilizarán vancomicina 125 mg vía oral cada 6 horas con la misma duración del tratamiento.(2,16,18)

Cuando tras 5-7 días de tratamiento con metronidazol no obtengamos una respuesta clínica favorable debe valorarse el cambio por vancomicina. (2)

2. Formas graves

Los casos graves de diarrea por C. difficile deben recibir tratamiento con esquemas basados en vancomicina. Las guías de la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas (IDSA) de 2010 proponían utilizar dosis altas de vancomicina, recomendando 500 mg cada 6 horas vía oral durante 10-14 días (2). Estudios posteriores con dosis menores demuestran que no existe diferencia en cuanto a duración de la diarrea y curación microbiológica. Por este motivo no existe evidencia que apoye la utilización de dosis mayores de 125 mg de vancomicina vía oral cada 6 horas durante 10-14 días en el tratamiento de las formas graves. (16,18)

3. Grave complicada

El tratamiento de las formas graves y complicadas precisa la combinación de varios fármacos administrados simultáneamente por distintas vías de administración. La mayoría de la bibliografía propone emplear tratamiento con vancomicina 500 mg vía oral cada 6 horas junto con metronidazol 500 mg iv cada 8 horas. El tratamiento podría complementarse con enemas con vancomicina a dosis de 500 mg en 500 ml de suero fisiológico cada 8 horas (2,16,18). El Colegio Americano de Gastroenterología(ACG) propone dos posibilidades de tratamiento en esta forma clínica. Recomiendan el tratamiento descrito previamente para pacientes en los que exista distensión abdominal y se muestran algo más conservadores en pacientes con una forma grave moderada sin distensión abdominal. En este grupo de pacientes, proponen vancomicina 125 mg cada 6 horas vía oral junto con metronidazol 500 mg iv cada 8 horas. (16)

4. Pacientes con imposibilidad 
de uso de vía oral

En los pacientes en los que no pueda emplearse la vía oral el uso de vancomicina carece de utilidad. Al tratarse de un fármaco con una excreción principalmente renal cuando se administra por vía intravenosa no se consigue concentraciones suficientes a nivel del colon para la erradicación del bacilo. Por esta razón, el tratamiento de la infección en paciente que no toleran la vía oral se realiza con metronidazol 500 mg intravenoso cada 8 horas. En los pacientes que presentan íleo paralítico puede aceptarse la utilización de vancomicina en enemas aunque no es una práctica estandarizada. (2,16,18)

En algunas series de casos se han obtenido buenos resultados con el empleo de tigeciclina iv en pacientes con formas graves en los que no se consigue respuesta satisfactoria con tratamiento intravenoso con metronidazol. De esta manera, se evita la necesidad de tratamiento quirúrgico en estos pacientes. (21)

TRATAMIENTO DE LA RECURRENCIA

La recurrencia de la diarrea por C. difficile se define como la reaparición de la clínica tras la retirada del tratamiento habiendo desaparecido esta durante el mismo. (2) El tratamiento de la recurrencia será diferente en función del número de episodios que presente el paciente.

1. Recurrencia única

Las guías IDSA de 2010 y el ACG proponen como tratamiento de la primera recurrencia un nuevo ciclo del fármaco administrado en el primer episodio utilizando como alternativa vancomicina vía oral (2,16).

En Europa se recomienda el uso de vancomicina 125 mg cada 6 horas o fidaxomicina 200 mg cada 12 horas para el tratamiento de la primera recurrencia. Se ha demostrado que el tratamiento con fidaxomicina es similar en eficacia presentando un menor riesgo de recurrencia posterior que con vancomicina.(19,20) Actualmente, en Europa se considera la primera opción terapéutica en la primera recurrencia aunque todavía existen pocos estudios que apoyen su uso de manera generalizada (16,18).

2. Recurrencia múltiple:

Cuando se producen varios episodios de recurrencia se recomienda realizar un tratamiento prolongado. Generalmente este tratamiento se basa en vancomicina 125 mg vía oral administrada en pulsos o en pauta descendente durante varias semanas. En la literatura europea se recomienda el tratamiento de la recurrencia múltiple con fidaxomicina 200 mg vía oral cada 12 horas durante 10 días con un grado de recomendación similar al de los esquemas a partir de vancomicina. (16,19, 20)

El ACG propone la utilización de trasplante de microbiota fecal con un grado de recomendación moderado en casos de diarrea por C.difficile. Este tratamiento estaría reservado para casos con múltiple recurrencia que no han respondido a antibioterapia con pulsos de vancomicina. Su indicación se basa en la hipótesis de la existencia de un desequilibrio en la flora nativa de los pacientes.(16) En las guías europeas de tratamiento publicadas en marzo de 2014 se revisa la indicación de esta medida que en ediciones anteriores no recomendaba.(22). Sin embargo, en su versión más reciente se recomienda el trasplante fecal junto con el tratamiento con un glicopeptido oral como una medida altamente eficaz para los casos que han recurrido en múltiples ocasiones.(18)

La utilización de inmunoglobulinas, especialmente gammaglobulinas, han sido analizadas en algunas series de casos valoradas en las guías de práctica clínica. A día de hoy, no existe evidencia suficiente para recomendar su uso en el tratamiento o prevención de la diarrea por C. difficile o su recurrencia. (2,16,18)

TRATAMIENTO QUIRÚRGICO

Los pacientes que presentan afectación sistémica que no responde al tratamiento médico, peritonitis, megacolon tóxico o perforación colónica van a precisar tratamiento quirúrgico (2,16,18). La cirugía consiste generalmente en practicar una colectomía subtotal.(2) El riesgo quirúrgico que presentan estos pacientes y la mortalidad derivada de la cirugía es mayor que en aquellos que son sometidos a la misma técnica sin la infección.(23) Sin embargo, la mortalidad en los pacientes con formas graves en los que se retrasa la cirugía, es mayor que en aquellos que se someten a cirugía de forma precoz. (23) Durante el manejo de pacientes con formas complicadas de la enfermedad el contacto entre clínico y cirujano debe ser estrecho con el fin de indicar la cirugía en los casos en los que sea necesaria.

Como alternativa a la colectomía subtotal se ha propuesto en los estudios publicados recientemente, la realización de una ileostomía de protección y administración tópica de tratamiento antibiótico como alternativa a la resección completa de colon. (24)

02 tabla1

 

MEDIDAS PREVENTIVAS

La infección por C. difficile es una infección mayoritariamente hospitalaria. Por este motivo los profesionales sanitarios debemos esforzarnos en evitar el desarrollo y la transmisión de la infección en nuestra práctica diaria.

Para evitar la adquisición de la infección es necesario un control estricto del uso de antibióticos.(2,4,16) Los hospitales que cuentan con protocolos de uso racional de antibioterapia presentan una menor incidencia de la infección. Los sistemas de notificación y monitorización de los casos durante las epidemias permiten identificar a los pacientes y tratarlos precozmente.(16)

La principal medida para evitar la propagación de la enfermedad consiste en el lavado de manos y fómites en contacto con el paciente infectado; utilizando siempre que sea posible material desechable en los cuidados de los pacientes infectados. (2,4,16) El lavado de manos debe llevarse a cabo con agua y jabón ya que las soluciones alcohólicas no garantizan la eliminación de las esporas del bacilo. (2) La desinfección de las superficies del entorno en el que se encuentra el paciente deben realizarse con soluciones esporicidas o en su defecto con agentes de limpieza con una concentración de 5000 ppm de cloro (16).

El paciente debe permanecer ingresado en una habitación individual siempre que sea posible. En el caso de que no tengamos disponible una habitación individual intentaremos agrupar a los pacientes infectados por el mismo patógeno. (2)

El personal sanitario y no sanitario así como los acompañantes del paciente deberán realizar medidas preventivas que eviten la contaminación durante el contacto con el paciente. El uso de guantes y bata es suficiente para evitar la propagación por contacto de la enfermedad. Las medidas de aislamiento deben mantenerse como mínimo hasta la resolución de la diarrea. (2,16)

CONCLUSIONES

• La diarrea por clostridium difficile supone la causa más frecuente de diarrea en el medio hospitalario(1) favorecido por el consumo de antibióticos y la edad (2,4).

• El diagnostico está basado principalmente en la clínica y algoritmos que combinan ELISA de GDH y toxinas de C. difficile. Contamos con técnicas diagnósticas que a pesar de ser muy sensibles en la práctica clínica habitual van a estar en un segundo plano debido al elevado tiempo de incubación que precisan. (2,4,16,17)

• Los estudios endoscópicos y de imagen serán especialmente útiles en los casos graves o las presentaciones atípicas de la enfermedad. (2,16,17)

• El tratamiento de la enfermedad se basa principalmente en la retirada de agente antimicrobiano causal y la antibioterapia con metronidazol o vancomicina oral según la gravedad del cuadro (2,16,18). Para el tratamiento de la recurrencia de la infección contamos con nuevos antibióticos como la fidaxomicina.(16,18)

• En los casos graves y complicados con afectación sistémica está indicada la colectomía subtotal.(2,16,18) El retraso en la indicación del tratamiento quirúrgico supone un aumento de la mortalidad (23).

• La principales medidas preventivas consisten en el uso responsable de antibióticos y el aislamiento de los pacientes hasta la desaparición de la diarrea.(2,4,16)

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CORRESPONDENCIA:

Dra. Carmen Martos Plasencia.

Sección de Aparato Digestivo. 
Hospital General Universitario de Ciudad Real.

Calle Obispo Rafael Torija s/n • 13005 Ciudad Real.

Telf: 926 278 000 – Ext (79606).

Email: carmenmartosplasencia@gmail.com

 
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ACTINOMICOSIS PANCREÁTICA: A PROPÓSITO DE UN CASO Y REVISIÓN DE LA LITERATURA

Maestro S 1, De Jesús K 1, Germade A 1, Moreira B 1, Sánchez-Barranco F 2, Berzal F 3, Pérez-Millán A1

Sección Aparato Digestivo1. Servicio de Medicina Interna2. Servicio de Anatomía Patológica3
Hospital Rio Carrión. CAUPA.

 

 

 

RESUMEN

La actinomicosis es una infección indolora, que progresa lentamente y causada por Actinomyces, un germen saprofito habitual; grampositivo, que forma unos grumos característicos llamados gránulos de azufre. En general, dependiendo del sitio de la infección primaria, se clasifica en cervicofacial, torácica y abdominal.

La actinomicosis abdominal es difícil de diagnosticar sin la realización de una exploración quirúrgica debido a que es una enfermedad poco frecuente y a que la clínica y la radiología son inespecíficas. El diagnóstico se basa en la identificación de los granulomas actinomicóticos en el contenido de los abscesos o bien con un cultivo positivo; que por otra parte, sólo se consigue en el 50% de los casos en el espécimen quirúrgico, consistiendo el tratamiento en una terapia antibiótica a largo plazo, asociada o no a resección quirúrgica.

Caso clínico: Se presenta un caso de actinomicosis abdominal que debutó como una masa pancreática que simulaba un tumor pancreático. La actinomicosis fue diagnosticada por una ecoendoscopia (USE) con PAAF. Se realizó tratamiento con penicilina durante seis meses con buena respuesta clínica y resolución de la infección.

Conclusión: Con la USE-PAAF se confirma el diagnóstico excluyendo así la malignidad y además permitiendo optar por un tratamiento con antibióticos y no quirúrgico

INTRODUCCIÓN

La Actinomicosis es una infección intraabdominal caracterizada por una enfermedad granulomatosa supurativa crónica causada por el Actinomyces israelii. Este patógeno produce una característica fibrosis inflamatoria granulomatosa y formación de masas abdominales.

CASO CLÍNICO

Varón de 66 años de edad que presenta cuadro de 4 meses de evolución de dolor abdominal asociado a mala respuesta a analgésicos opioides y fiebre ocasional. Sin antecedentes de consumo de alcohol o de intervenciones quirúrgicas previas.

Acudió a la unidad de Gastroenterología de otro Hospital donde se le realizaron unos estudios básicos y un TAC con contraste objetivándose en el cuerpo pancreático una masa sólida de 18 x 16 mm.

El paciente fue derivado a nuestra Unidad de Endoscopias, donde se le realizó una USE objetivándose una lesión redondeada hipoecoica en cuerpo pancreático. Posteriormente, se realizó una PAAF, que fue concluyente para el diagnóstico. No hubo ninguna complicación inmediata después de la punción. El análisis histopatológico demostró fibrosis crónica y la presencia de actinomicosis (Figura 1).

El paciente presentó buena respuesta clínica después de un curso de un año con antibioterapia (penicilina). Este antibiótico se elige de acuerdo con la política antimicrobiana del Hospital (en nuestro caso fue G-penicilina). Se repitió la USE tras el tratamiento, mostrando una resolución parcial de la masa, y en la nueva biopsia no se encontróActinomyces (Figura 2).

DISCUSIÓN

La actinomicosis es una infección poco común que se puede presentar de forma subaguda o crónica, causada porbacterias filamentosas (actinomicetos). Constituyen un grupo heterogéneo relacionado con corinebacterias y micobacterias, superficialmente parecidos a los hongos. Actinomyces israelii, es el principal responsable de actinomicosis en humanos (1), se trata de una bacteria Gram positiva, difícil de cultivar (<4%),(2) no formadora de esporas, sensible a penicilina y no a anfotericina B.

Se caracteriza por la diseminación contigua, supurativa, inflamación granulomatosa y formación de múltiples abscesos y fístulas.

Los actinomicetos son unos comensales normales del organismo, principalmente de la cavidad oral, pero menos prominente en el tracto gastrointestinal inferior y el tracto genital de la mujer, pudiendo tornarse patógeno después de un traumatismo, infección local o cirugía que altere las barreras mucosas naturales del organismo, invadiendo los tejidos adyacentes(3). La infección generalmente se propaga de forma contigua, invadiendo los tejidos u órganos circundantes.La diseminación hematógena a órganos distales puede ocurrir en cualquier etapa de la actinomicosis; siendo la diseminación linfática inusual.

La actinomicosis abdómino-pélvica aparece solo en un 20% de los casos reportados en la literatura, siendo aún más raros los casos de actinomicosis pancreática(4). Son anecdóticos los casos comunicados, siendo difícil de distinguir de una masa maligna en las imágenes del TAC. Por lo general, estos pacientes tienen antecedentes de cirugía abdominal (por ejemplo, apendicitis aguda perforada, diverticulitis de colon perforado, trauma abdominal) o la ingestión de cuerpos extraños. Cabe recordar que nuestro paciente no tenía antecedentes quirúrgicos.

La actinomicosis abdominal se presenta clínicamente con fiebre, pérdida de peso, fatiga, cambios en los hábitos intestinales, dolor abdominal inespecífico, náuseas, vómitos y sensación de masa que pueden imitar síntomas neoplásicos (5, 6). Fue después de la PAAF de páncreas cuando se obtuvo el diagnóstico de una infección granulomatosa. En la mayoría de los casos de actinomicosis, la terapia antimicrobiana es el único tratamiento requerido, aunque la cirugía puede ser complementaria en casos seleccionados. El tratamiento de elección consiste en altas dosis de penicilina G, durante un período prolongado (de 6 meses a 1 año), pero se han confirmado buenos resultados con períodos de tratamientos más cortos; lo que indica que el tratamiento debe adaptarse a cada paciente de acuerdo con la clínica y la respuesta radiológica (7, 8).

Cuando la actinomicosis es bien diagnosticada y tratada, el pronóstico es excelente. Sin embargo, en las formas extendidas y complicadas,el exitus letalis puede acontecer a pesar de dicha terapia (9).

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Figura 1.- Masa basófila con inclusiones eosinofílicas compatibles con actinomices (tinción de H-E)

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Figura 2.- Infiltrado linfocítico sin presencia de actinomices (tinción de H-E)

 

 

CONCLUSIÓN

La actinomicosis abdominal es una infección muy poco común que puede similar varias patologías, por lo que requiere un diagnóstico preciso para poder lograr una terapia exitosa. No todos los tumores pancreáticos son neoplásicos, y en este caso la PAAF tiene un papel esencial.

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ADENOCARCINOMA PAPILAR SEROSO PRIMARIO DEL EPIPLÓN MAYOR: “OMENTAL CAKE”. PRESENTACIÓN DE UN CASO

Mª Belén Rodríguez Sanz

Servicio de Cirugía General y del Aparato Digestivo. Complejo Asistencial de Ávila.

 

 

 

 

RESUMEN

El adenocarcinoma papilar seroso primario del peritoneo es una entidad maligna rara que afecta a mujeres predominantemente postmenopáusicas. Se trata de una patología indistinguible de la carcinomatosis peritoneal del carcinoma de ovario.

Se debe plantear el diagnostico diferencial con otras patologías como el mesotelioma peritoneal maligno que se asocia con la exposición al asbesto, tuberculosis peritoneal, linfomatosis peritoneal y sobre todo con la carcinomatosis de ovario.

Presentamos un caso clínico de una mujer de 66 años con carcinoma peritoneal primario en el epiplón mayor.

PALABRAS CLAVE

Carcinoma peritoneo. Omental Cake.

INTRODUCCIÓN

El omento o epiplón mayor es el pliegue peritoneal de mayor tamaño en el abdomen. Es la continuación del ligamento gastrocólico y está formado por una doble reflexión del mesogastrio dorsal, por lo tanto se compone de cuatro hojas de peritoneo.

“Omental cake” se define como engrosamiento anormal del epiplón mayor. Es una infiltración de la grasa omental, típicamente causada por infiltración de tumores metastásicos como estómago, ovario o colon; aunque también se infiltra por tuberculosis peritoneal, linfomas, o de forma primaria, por tumores de carácter neoplásico.

El carcinoma papilar seroso primario del peritoneo (CPSPP) es una neoplasia rara cuya incidencia se estima es de 6.8 casos por millón de habitantes (1). Fue descrito por primera vez por Swerdlow en 1959 (2), pero es en 1977 cuando Kannerstein y col. establecen criterios de diferenciación con el mesotelioma maligno (3).

Se cree que deriva del revestimiento mesotelial de la pelvis extraovárica y región inferior del abdomen, se considera una entidad patológica de origen mülleriano (4-5).

Se han descrito varios tipos histológicos, pero seroso es el más frecuente (6-7), esta variante como la que presentamos en nuestro caso clínico se asocia más frecuentemente con factores pronósticos desfavorables como invasión linfovascular, penetración miometrial profunda, metástasis ganglionares y mala evolución.

Se caracteriza por afectación masiva del peritoneo con escasa o nula afectación de la superficie del ovario, incluso puede desarrollarse en mujeres con ooforectomía bilateral previa independientemente de su patología benigna o maligna. (8)

Debido al origen embriológico común del mesotelio del peritoneo y el epitelio germinal del ovario, las características clínicas e histológicas del CPSPP son casi indistinguibles a las del carcinoma papilar seroso del ovario.

CASO CLÍNICO

Mujer de 66 años de edad con antecedentes de hipertensión arterial, valvulopatía mitral, hipertensión pulmonar y parálisis diafragmática. Acude al servicio de urgencias por cuadro de dolor abdominal supraumbilical inespecífico y distensión abdominal de dos meses de evolución.

En la analítica solo destaca la discreta-moderada elevación del CA 125 con un valor de 237 U/ml siendo los marcadores tumorales CEA, CA 19.9, CA 15.3, alfafetoproteína y BHGC normales.

En la exploración física: abdomen globuloso, blando y depresible doloroso a la palpación difusa principalmente en hemiabdomen superior sin defensa ni signos de irritación peritoneal. Se palpa engrosamiento difuso-masa en mesogastrio.

Se realiza TAC abdominal con presencia de inflamación irregular de la pared anterior, engrosamiento difuso e irregular del epiplón mayor sugerente de “omental cake” o masa de tejido denso que ha sustituido totalmente la estructura grasa del epiplón (Figura 1).

A la paciente se le realizaron gastroscopia, colonoscopia mamografías que fueron normales. En la ecografía vaginal los anejos son de morfología y tamaño normales. Se solicito tomografía con emisión de positrones en la que se describe una hipercaptación de la pared anterior del hemiabdomen derecho (Figura 2).

Se realiza laparotomía media exploradora donde se evidencia bloque tumoral del epiplón con adherencias firmes del intestino delgado e hígado sin presencia de metástasis macroscópicas visibles. (Figura 3) En la biopsia intraoperatoria es positivo para adenocarcinoma. Se efectúa resección del 95% del epiplón con conservación del intestino delgado. A la semana de la intervención se traslada a la paciente a un centro hospitalario de referencia en cirugía radical peritoneal donde se desestimó reintervención por considerar que era suficiente la resección de la primera cirugía. Posteriormente la paciente recibió tratamiento adyuvante con quimioterapia administrándole de inicio la combinación recomendada de Taxanos con carboplatino (carboplatino paclitaxel). El resultado de la Anatomía Patológica fue de carcinoma papilar seroso primario del peritoneo.

A los cuatro meses reingresa por dolor abdominal y vómitos ocasionales con disconfort abdominal y distensión. En el TAC de control recidiva tumoral con pequeños implantes micronodulares mesentéricos y en el resto del epiplón sugerente de carcinomatosis sin presencia de ascitis. Se inicia un nuevo ciclo de quimioterapia incluyendo un tercer medicamento como es el Irinotecan. La paciente fallece un mes después del reingreso por carcinomatosis difusa y cuadro de obstrucción intestinal de origen tumoral.

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Figura 1.- Engrosamiento del epiplon.
 
 
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Figura 2.- Hipercaptación del epiplón.

 

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Figura 3.- Imagen quirúrgica de la neoplasia de epiplón 

 

 

DISCUSIÓN

El carcinoma seroso papilar representa el 1-2% de todos los canceres peritoneales primarios, por tanto se trata de una patología rara de baja frecuencia, considerablemente más baja que el carcinoma seroso papilar del ovario (1).

La característica principal del CPSPP es la afectación peritoneal difusa con mínima o ninguna afectación ovárica, nuestra paciente en el momento del diagnóstico solamente presentaba afectación masiva del epiplón mayor sin difusión peritoneal, parietal ni visceral.

El cáncer primario de peritoneo ocurre casi exclusivamente en mujeres, aunque se han descrito dos casos en varones (9) sin antecedentes de exposición al asbesto. En un estudio realizado por Halperin y col (10) hace referencia a que las mujeres con CPSPP tienen una menarquía más temprana, mayor número de embarazos y más baja incidencia familiar para el cáncer ginecológico que en mujeres con neoplasias de ovario. Las mujeres con mutación del BRCA1 tienen más riesgo de desarrollar CPSPP en un 5-10% y tienen sobreexpresión de p53. Parece que son tumores hormono dependientes.

Un grupo de Oncología Ginecológica GOG estableció ciertos criterios para el diagnóstico:

• Ovarios de tamaño normal menores o igual a 3 cm o aumentados de tamaño por proceso benigno.

• Ausencia de compromiso ovárico o limitado a la superficie.

• Histología de tipo seroso.

• Volumen de afectación extra ovárica significativamente mayor que de ovario.

Los síntomas clínicos son variados (Tabla I). Nuestra paciente al ingreso solo presentaba dolor abdominal inespecífico y distensión abdominal sin otra sintomatología acompañante.

La elevación del CA 125 está presente en más del 90% (> de 35.0 µgr/ml) (12), no obstante este dato no es diagnóstico de carcinoma peritoneal, dado que aparece en el 1% de la población sin afectación tumoral como en pacientes cirróticos. Es útil en el seguimiento y evolución de la enfermedad en los pacientes intervenidos quirúrgicamente. No se ha demostrado la utilidad de otros marcadores tumorales para este tipo de neoplasia.

La diseminación se produce de forma transperitoneal. El sitio más frecuente y común es el epiplón en 90-100% (Tabla II), sin embargo, nuestra paciente desarrolla la neoplasia en el epiplón mayor con posterior diseminación al peritoneo.

El diagnóstico se efectúa con técnicas de imagen como Radiología simple de tórax para descartar metástasis. Ecografía abdominal y TAC con signos de engrosamiento peritoneal nodular focal o difuso, omental cake, masas irregulares, ascitis, derrame pleural, calcificaciones del tumor, adenopatías y ovarios normales (13). Determinación del CA125 es útil para el diagnostico (14). Altras y col. (15) consideran que los valores de este marcador se correlacionan con el estadio y las respuestas al tratamiento.

Se debe realizar diagnostico diferencial con el mesotelioma maligno, linfomatosis, carcinoma metastásico de ovario y con menor frecuencia metástasis de carcinoma de estomago, colon, mama o páncreas.

El tratamiento de elección es la cirugía de citorreducción que en el 98% debe ser extensa por tumor diseminado. Debe incluir histerectomía, salpingooforectomía bilateral, omentectomía, resección intestinal solo para prevenir la obstrucción intestinal y esplenectomía. El objetivo del tratamiento es realizar cirugía, citorreducción óptima con enfermedad residual menor de un centímetro de diámetro, esta cirugía se consigue solo en menos del 50% de los casos (33-69%) (14). En el caso de nuestra paciente solo efectuamos resección del tumor porque se trasladaba a un hospital de referencia para cirugía radical total R0 que posteriormente se desestimó en dicho hospital. La terapia neoadyuvante utiliza el cisplatino, actualmente se recomienda la combinación de dos quimioterápicos como el carboplatino/paclitaxel y se está estudiando últimamente si es beneficiosa la asociación de un tercer quimioterápico como la ciclofosfamida o el irinotecan (16). La supervivencia media es de 7-24 meses, siendo la tasa de supervivencia a los 5 años del 0-22%.

Concluimos diciendo que el CPSPP es una neoplasia poco frecuente que representa el 1-2% de todos los cánceres peritoneales. Se debe hacer diagnostico diferencial con la carcinomatosis de ovario. Se debe sospechar si hay una elevación del CA 125 con ovarios normales. El tratamiento es la cirugía de citorreducción óptima asociado a quimioterapia. Tienen mal pronóstico con una supervivencia media muy baja.

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CORRESPONDENCIA:

Mª Belén Rodríguez Sanz

Servicio de Cirugía General y del Aparato Digestivo. Complejo Asistencial de Ávila

Avenida Juan Carlos I, s/n • 05071 ÁVILA

brosanz@yahoo.es

Tel.: 646.874.565 • 983.243.718

Cambios en la Microbiota en la Enfermedad Celiaca: ¿Causa o Consecuencia?

BEATRIZ MARTÍNEZ-ABAD, JOSÉ A. GARROTE, CELIA ESCUDERO-HERNÁNDEZ, EDUARDO ARRANZ

Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM), Universidad de Valladolid-CSIC. Valladolid. Laboratorio de Genética y Biología Molecular. Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Universitario “Rio Hortega”. Valladolid.

 

 

La enfermedad celiaca (EC) es una enteropatía del intestino delgado que afecta a individuos predispuestos genéticamente desencadenada por la ingesta de gluten. Todos los pacientes celiacos presentan los alelos de riesgo HLA-DQA1 y HLA-DQB1 cuyos productos de expresión forman parte de las moléculas de presentación antigénica HLA-DQ2 y HLA-DQ8. Sin embargo, no todos los individuos que presentan este perfil genético desarrollan la enfermedad, por lo que los factores ambientales influyen en gran medida en la expresión de la misma (1).

En un estudio reciente en niños se ha demostrado que el genotipo HLA-DQ2 influye en la selección de las bacterias que compondrán finalmente la microbiota. Los pacientes a la edad de un mes, portadores de los alelos de riesgo y con al menos un familiar celiaco de primer grado presentan una mayor proporción de Firmicutes y Proteobacteria y una menor proporción de Actinobacteria (2).

Los niños celiacos en actividad muestran un mayor número de Escherichia coli (Proteobacteria), Staphylococcus (Firmicutes), Bacteroides – Prevotella (Bacteroidetes) y Clostridium (Firmicutes) y una disminución de Bifidobacterium (Actinobacteria) (3-5). Los grupos de E. coli y Staphylococcus, están asociados al ambiente proinflamatorio presente en los pacientes en actividad y recuperan sus niveles basales en los pacientes en dieta sin gluten (DSG). Sin embargo, otros grupos como los Bacteroides, no recuperan los niveles de los individuos sanos (3), por lo que estas bacterias podrían desempeñar un papel más relevante en la EC. Algunas especies de bacterias son dependientes de algún modo de la presencia del gluten. Tanto en el duodeno de los pacientes celiacos adultos en actividad como de los individuos sanos se han encontrado secuencias del ARN ribosomal 16S, pertenecientes a bacterias desconocidas, que están ausentes en los pacientes en DSG (6). Además, en los pacientes adultos en DSG hay una menor diversidad de Lactobacillus y Bifidobacterium en comparación con los pacientes en actividad y los individuos sanos (7). Curiosamente, en individuos sanos también se ha demostrado que seguir una DSG modifica la composición de la microbiota disminuyendo la prevalencia de Lactobacillus y Bifidobacterium e incrementando la de E. coli y Enterobacteriaceae (8).

Todos estos estudios demuestran que el gluten modifica el ecosistema del intestino tanto en pacientes celiacos como en individuos sanos. En la actualidad se está estudiando el papel de estas bacterias en el metabolismo del gluten y su efecto en modelos in-vitro. En un primer momento se detectó una actividad proteolítica, con un posible origen bacteriano, sobre la gliadina en biopsias de pacientes celiacos (9). Estudios posteriores identificaron varias especies de bacterias capaces de digerir el gluten en las heces de individuos sanos que clasificaron principalmente como Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Clostridium, Bacillus y Enterococcus (todos ellos Firmicutes) y Bifidobacterium (Actinobacteria) (10). Incluso, algunas especies comensales identificadas en este estudio son capaces de digerir el péptido tóxico derivado de la gliadina, 33-mer (10). Bifidobacterium longum, que se encuentra en menor número en el intestino de los niños celiacos (5), metaboliza los péptidos procedentes de la digestión de la gliadina dando lugar a otros péptidos que no son tóxicos en ensayos in-vitro (11). En cambio Bacteroides fragilis, más abundante en pacientes celiacos que en individuos sanos, produce péptidos más tóxicos aún que los derivados de una simulación de la digestión gastrointestinal de la gliadina (12). En un trabajo publicado en este mismo ejemplar, Nistal et al. utilizaron biopsias procedentes de pacientes celiacos, tanto de niños como de adultos en actividad y en DSG, e individuos sanos y las cultivaron en medio de cultivo con gluten como única fuente de nitrógeno. De esta manera seleccionaron las bacterias presentes en el duodeno capaces de beneficiarse de la presencia del gluten. Las especies  mayoritarias que crecieron en este medio fueron Streptococcus salivarius y S. oralis; y en menor medida especies pertenecientes a Lactobacillus, Gemella, Clostridium, Granulicatella, Staphylococcus (todos ellos Firmicutes) y Haemophilus (Proteobacteria). Aunque no se encontró un perfil diferencial entre individuos sanos y pacientes celiacos, conocer qué especies bacterianas están presentes o ausentes en el duodeno de los pacientes celiacos e individuos sanos con capacidad de metabolizar el gluten, ayudaría a establecer un cerco sobre las posibles bacterias implicadas en la patogenia de la EC.

En resumen, si los cambios sobre algunos grupos bacterianos son consecuencia del propio genotipo del huésped, del ambiente proinflamatorio o de la presencia del gluten en el intestino, o bien, si el papel de ciertas bacterias con capacidad para digerir el gluten podría ser clave en la susceptibilidad, el desarrollo, o la cronificación de la EC, es la pregunta que subyace en todos estos estudios. Gracias a las técnicas moleculares se ha podido avanzar en el conocimiento y la identificación de las bacterias que habitan en el intestino de los pacientes con EC, sin embargo, son necesarios ensayos funcionales que ayuden a determinar la relación de estas bacterias con las proteínas del gluten y con el propio huésped, y a explicar si su presencia puede resultar perjudicial para estos pacientes.

 

 

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