CORRESPONDENCIA
Esther Nistal
Complejo Asistencial Universitario de León.
Altos de Nava s/n. 24071 León.
esthernistal@hotmail.com
Introducción
La obesidad es actualmente uno de los principales problemas de salud pública, debido a su creciente prevalencia, y se asocia a otras enfermedades como la resistencia a la insulina, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) o el síndrome metabólico[1]. El desarrollo de la obesidad está determinado por una compleja interacción entre factores genéticos, ambientales, culturales, sociales y el gasto energético, el cual está altamente influenciado por el nivel de actividad física de cada individuo[2]-[5]. Recientemente, la microbiota intestinal ha pasado a ser considerada como uno de los nuevos factores clave que participan en la obesidad y en los trastornos metabólicos asociados. De hecho, se ha demostrado que ratones carentes de microbiota intestinal son resistentes a desarrollar obesidad, esteatosis y resistencia a la insulina inducida por una dieta rica en grasa[6], [7]. Por otro parte, también se ha confirmado la capacidad de la microbiota intestinal de asimilar nutrientes, así como su participación en la regulación de genes encaminados a favorecer el almacenamiento lipídico en el tejido adiposo y en el hígado[8], lo que podría explicar en parte dicho efecto sobre el peso y su relación con el desarrollo de síndrome metabólico y de hígado graso no alcohólico[9], [10]. Además, se han mostrado cambios en la composición de la microbiota intestinal tanto en animales como en pacientes humanos obesos en comparación con individuos delgados[11]. La mayoría de los estudios han reflejado un descenso relativo en la abundancia de filo Bacteroidetes frente un incremento en el filo Firmicutes asociado a la población obesa, así como un descenso en la diversidad bacteriana en dichos pacientes[12], [13]. Sin embargo, estos hallazgos están sujetos a una gran controversia por lo que no se pueden generalizar[14], [15].
Los tratamientos tradicionales basados en dietas hipocalóricas y el aumento de la actividad física han tenido cierto éxito en el control de la obesidad. Sin embargo, por lo general estas estrategias dan lugar a reducciones de peso limitadas y temporales, lo que justifica el planteamiento de nuevos enfoques terapéuticos como podría ser la modulación de la microbiota intestinal. Estas estrategias incluyen la administración de prebióticos que estimulan el crecimiento y/o la actividad metabólica de las bacterias beneficiosas o el aporte de probióticos en forma de alimentos funcionales y/o suplementos[16]-[18]. Asimismo, recientemente se ha propuesto la utilidad del trasplante de microbiota intestinal como mecanismo terapéutico[19]. Por todo ello, el objetivo del presente estudio fue comprobar la relación existente entre una determinada riqueza y diversidad de la microbiota intestinal y la presencia de un fenotipo metabólico concreto, comparando dicha microbiota en individuos sanos frente a obesos y a su vez dentro de estos últimos, considerando las diferencias asociadas al desarrollo de síndrome metabólico y su manifestación hepática, la enfermedad de hígado graso no alcohólico.
Material y métodos
Pacientes y muestras fecales
Se recogieron muestras fecales de pacientes obesos adultos (rango de edad entre 20 y 60 años) procedentes de los Servicios de Aparato Digestivo del Complejo Asistencial Universitario de León (CAULE) y del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. 73 sujetos fueron incluidos en este estudio, distribuidos en 53 pacientes obesos (30 pacientes obesos de León y 23 pacientes obesos de Santander) y 20 individuos sanos control (10 individuos sanos de León y 10 controles de Santander). Todos los pacientes fueron caracterizados en detalle desde un punto de vista demográfico (edad, sexo y raza), con un número equivalente de hombres y mujeres dentro de la muestra total. También se les analizó desde un punto de vista antropométrico (índice de masa corporal y perímetro de cintura y cadera) y bioquímico plasmático (glucosa, creatinina, insulina, colesterol total, LDL y HDL, triglicéridos y enzimas hepáticas). Asimismo, se comprobó la resistencia a la insulina utilizando el modelo homeostático (HOMA-RI). En todos los sujetos del estudio se determinó de modo semi cuantitativo la existencia de esteatosis mediante la realización de una ecografía abdominal y se valoró la presencia de fibrosis con la realización de elastometría de transición (Fibroscan) y en algunos casos seleccionados, en función de los requerimientos clínicos, se practicó una biopsia hepática, que confirmó la presencia de esteatosis y/o fibrosis. Todos los pacientes fueron seronegativos para el virus de la Hepatitis B, virus de la Hepatitis C y virus de la inmunodeficiencia humana.
En el caso de los individuos control, las muestras fecales fueron obtenidas a partir de individuos voluntarios sanos sin sobrepeso que no presentaban enfermedades diagnosticadas, ni síntomas de enfermedades digestivas conocidas en el momento de la toma de las muestras. La recepción de las muestras fecales se llevó a cabo en ambos complejos hospitalarios por parte del personal del Servicio de Aparato Digestivo. Los pacientes llevaron las muestras a temperatura ambiente en un recipiente estéril que se le proporcionó en el mismo hospital días previos a la recogida. Una vez recogidas, las muestras fecales fueron homogeneizadas, alicuotadas y congeladas (-80ºC) en un tiempo no superior a 3 horas tras la defecación. Ninguno de los individuos incluidos en el estudio fue tratado con antibióticos durante al menos un mes antes de la toma de las muestras. En todos los casos se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes incluidos en el estudio a la toma de muestras. Así mismo, se solicitó la aprobación de los protocolos de estudio por parte de la Comisión de Ética de ambos hospitales.
Extracción de ADN de las muestras fecales
La extracción de ADN genómico se llevó a cabo a partir de 200 mg de las diferentes muestras fecales empleando el kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Hilden, Germany) siguiendo el protocolo que aporta el kit, con alguna modificación. Se incluyó un paso previo de lisis mecánica empleando perlas de vidrio (0,7 mm) durante diez minutos y la temperatura de lisis se incrementó para así facilitar la extracción de ADN de células bacterianas difíciles de lisar. La concentración de ADN extraído de cada una de las muestras fue determinada empleando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 y se almacenó a -20ºC hasta su amplificación.
Amplificación mediante PCR del 16S rDNA
A partir del ADN extraído de cada una de las muestras fecales, se llevó a cabo una reacción de PCR empleando cebadores universales correspondientes a las regiones V3-V4 del ARN ribosomal 16S. Como primer forward se empleó el cebador 5’tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagCCTACGGGNGGCWGCAG3’ y como primer reverso, el cebador: 5’gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagGACTACHVGGGTATCTAATCC3’20. Dichos cebadores llevan acoplados al extremo 5’ un adaptador específico (indicado en letras minúsculas) para la posterior secuenciación con el sistema MiSeq de Illumina. Las condiciones de PCR empleadas fueron 3 min a 95ºC, seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC y 30 segundos a 72ºC, y una extensión final a 72ºC durante 5 minutos. Cada mezcla de reacción (25 μl) contenía 50 ng de ADN genómico, 0,5 μl del primer forward (0,2 μM), 0,5 μl de primer reverso (0,2 μM) y 12,5 μl de 2x KAPA HifiHotStart Ready Mix (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA). Por cada individuo se llevaron a cabo 3 reacciones de PCR que se mezclaron y posteriormente se purificaron empleando el kit comercial Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, USA).
Pirosecuenciación con MiSeq System de Illumina
La mezcla de productos de PCR purificados se envió al servicio de pirosecuenciación de la Universidad de Cantabria donde se empleó el secuenciador MiSeq (Illumina). En la secuenciación se añadieron índices a las muestras para poder analizarlas de forma simultánea, y asignar cada lectura a la muestra de la que procedía.
Análisis bioinformático y estadístico
Para el análisis de los datos se empleó la aplicación 16S Metagenomics Basespace en el portal online de Illumina (https://basespace.illumina.com/home/index). Esta aplicación proporciona un flujo de trabajo específico para las secuencias del ARN ribosomal 16S de la subunidad pequeña de los ribosomas. Incluye el filtrado de las secuencias por su calidad, asignación de las lecturas a cada muestra a partir de los índices, eliminación de cebadores, ensamblado de las secuencias a partir de las lecturas en los sentidos directo e inverso. La aplicación también permite la clasificación taxonómica de las secuencias utilizando la herramienta Classifier del RDP (Ribosomal Database Proyect, http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp) utilizando como referencia la base de datos de secuencias 16S del Greengenes (Mayo, 2013) y la asignación de las secuencias a OTUs (Unidades Taxonómicas Operacionales) con la herramienta Clustering (también del RDP) utilizando una identidad mínima del 97%.
Con el objeto de comparar las diferentes comunidades de bacterias estudiadas presentes en el colon de individuos con normopeso y pacientes obesos se hizo un análisis estadístico utilizando los paquetes estadísticos SPSS versión 22.0 para Windows y R, en este último caso utilizando el paquete Vegan, programado para el análisis específico de comunidades ecológicas (http://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html). En todos los casos los valores de p inferiores a 0,05 en los test estadísticos se consideraron significativos. También se ha determinado la riqueza de las comunidades de bacterias estudiadas basándose en el número de filotipos u OTUs presentes mediante un análisis de rarefacción, empleando también el paquete Vegan.
Resultados
Composición de las comunidades de bacterias a nivel de filo
Se obtuvo un total de 19.683.256 secuencias mediante un análisis de pirosecuenciación a partir de 73 muestras fecales con una media de 269.634 ± 145.866 secuencias por muestra. Cada librería contenía entre 41.604 y 999.815 lecturas. La mayoría de las secuencias identificadas a partir de las muestras fecales se clasificaron dentro de tres filos. Los filos Firmicutes (46%) y Bacteroidetes (45%) fueron los más representativos, seguidos por el filo Proteobacteria (4%) que aparece en menor proporción. Estos tres filos representan más del 90% de las secuencias analizadas. La figura 1A muestra la composición relativa de bacterias a nivel de filo para ambos grupos, control y obeso. El análisis estadístico mostró diferencias significativas asociadas a la obesidad en el filo Proteobacteria (p<0,05; prueba U de Mann-Whitney) respecto a los individuos control (Figura 1B). Asimismo, cabe destacar la existencia de diferencias significativas dentro del filo Firmicutes entre pacientes obesos con NAFLD y sin NAFLD (p<0,05) (Figura 1B). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el ratio Firmicutes/Bacteroidetes entre pacientes obesos e individuos control.
Figura 1
A) Diagrama sectorial mostrando la distribución de los filos bacterianos en muestras fecales de individuos control y pacientes obesos. En cada sector se indica el porcentaje correspondiente de cada uno de los filos. B). Box plot reflejando las principales diferencias significativas a nivel de filo mediante el Test U de Mann-Whitney (p<0,05).
Composición de las comunidades de bacterias a nivel de género
El análisis filogenético de las secuencias determinó la presencia de 617 géneros de bacterias conocidas a partir de muestras fecales de pacientes obesos e individuos control. En la figura 2 aparecen representados los géneros que presentaban más de 1.000 secuencias, mientras que la detección del resto de los géneros tuvo lugar en menor proporción. La mayoría de las secuencias pertenecieron a los géneros: Bacteroides, Prevotella, Blautia, Faecalibacterium, Clostridium y Oscillospira (Figura 2).
Figura 2
Número medio de secuencias de los géneros bacterianos conocidos encontrados en las muestras fecales de individuos control y pacientes obesos. Los géneros representados en la gráfica mostraron más de 1.000 lecturas.
El número de secuencias de Blautia, Oscillospira, Flavobacterium, Alkaliphillus y Eubacterium fue menor en pacientes obesos que en individuos control. El Test U de Mann-Whitney indicó que estas diferencias fueron significativas (p<0,05) en función del diagnóstico de obesidad. Por el contrario, el número de secuencias de Prevotella, Megasphaera, Lactobacillus, Meganomas y Acidaminococcus reveló un incremento significativo en pacientes obesos (p<0,05) (Figura 3).
Riqueza de las comunidades de bacterias
Se estudió la riqueza bacteriana en los pacientes obesos y en los individuos control de ambas localizaciones geográficas. El análisis de riqueza bacteriana en la provincia de León mostró la presencia de 182,82 ± 22,87 OTUs en los individuos control y 249,86 ± 27,41 OTUs en pacientes obesos. Resultados similares se obtuvieron a partir de las muestras fecales de la provincia de Santander. En los individuos control la riqueza bacteriana (178,42 ± 31,22 OTUs) fue inferior a la detectada en los pacientes obesos (232,52 ± 53,76 OTUs). Respecto a los individuos control, las muestras fecales de Santander presentaron una riqueza bacteriana menor que la correspondiente a los individuos control procedentes de León. Resultados similares se observan en los pacientes obesos. El análisis estadístico mostró que existían diferencias significativas en la riqueza bacteriana entre los dos grupos, con normopeso y obesos, tanto en conjunto como considerando ambas localizaciones geográficas por separado (p<0,05) (Figura 4).
Figura 4
Comparación de la riqueza bacteriana entre individuos control y pacientes obesos en ambas localizaciones geográficas. Las flechas entre las columnas representan las diferencias significativas que existen entre las comunidades bacterianas determinadas mediante el Test U de Mann-Whitney (p<0,05).
Análisis comparativo de las comunidades de bacterias
Una vez estudiada cada comunidad de bacterias en cuanto a su composición, seguidamente se midió la diversidad Beta en las muestras fecales tanto de individuos control como de pacientes obesos con el fin de determinar si existían diferencias en la composición global de las comunidades de bacterias entre los dos grupos.
Se realizó un Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) basado en el índice de desemejanza Chao (este índice es cualitativo, considera la presencia de OTUs comunes o diferentes en las comunidades comparadas) con el objetivo de estudiar los factores que explican la variación entre las distintas comunidades de bacterias (procedentes de 20 individuos control y 53 pacientes obesos). La figura 5 muestra que las comunidades de bacterias de los individuos control se agrupan de forma separada respecto a las comunidades de pacientes obesos en función del eje 1 que explica un 3,75% de la varianza total en el PCoA. Algunas comunidades de bacterias de los pacientes obesos se encuentras dispersas a lo largo de este eje. El resto de los ejes explican una proporción de la varianza relativamente bajo y no aportó información acerca de la variación de las comunidades.
Discusión
Durante décadas, el estudio de la microbiota bacteriana que forma parte del ecosistema intestinal se ha realizado a través de técnicas clásicas obteniendo cultivos puros. Sin embargo, muchas de las bacterias no se cultivan fácilmente en el laboratorio[21], por lo que es necesario recurrir al empleo de las técnicas moleculares para obtener una idea más detallada de la composición de la microbiota intestinal. El avance más reciente en el desarrollo de estas técnicas es la “metagenómica” que permite el análisis rápido de comunidades microbianas presentes en un determinado nicho ecológico, obteniendo un rendimiento mayor de lo que anteriormente era posible[22]. Durante los últimos años, varios proyectos han intentado mediante estas técnicas descifrar la estructura y funcionalidad de la microbiota intestinal humana, así como su relación con determinadas enfermedades gastrointestinales[23]-[27]. Esto ha permitido considerar a la microbiota intestinal como un nuevo factor implicado en la regulación del peso corporal y las enfermedades asociadas a la obesidad[28].
En este estudio, la composición y la diversidad de las comunidades de bacterias presentes en muestras fecales de individuos sanos con normopeso y pacientes obesos se han realizado mediante una de las técnicas más resolutiva de secuenciación de alto rendimiento, la pirosecuenciación. Los resultados han mostrado que la mayoría de las secuencias identificadas a partir de las muestras fecales tanto en individuos control como en pacientes obesos pertenecen principalmente a los filos Firmicutes, y Bacteroidetes, y en menor proporción al filo Proteobacteria. En varios trabajos se ha observado que los pacientes obesos presentan un incremento del filo Firmicutes y una reducción del filo Bacteroidetes con respecto a los individuos delgados[29]-[32]. Sin embargo, en nuestras muestras no se han encontrado diferencias significativas en la frecuencia relativa de los filos Firmicutes y Bacteroidetes entre pacientes obesos e individuos control, mientras que si se encontraron diferencias significativas asociadas al filo Proteobacteria. Los pacientes obesos presentan una frecuencia relativa mayor de este filo que los individuos control, permitiendo asociar este filo como un posible marcador asociado a la obesidad. Resultados similares con relación a este filo han sido obtenidos tanto en humanos como en ratones[33]-[35]. Esta discrepancia en los resultados a nivel de filo sugiere que el estudio de la composición de la microbiota intestinal podría estar asociado a varios factores como los criterios de selección de los pacientes, la dieta, la evolución de las técnicas moleculares, los diferentes métodos de extracción de ADN de las muestras, los métodos de amplificación y/o las tecnologías de secuenciación[36], [37].
Estudios previos han mostrado cambios en la composición de la microbiota intestinal entre pacientes obesos y no obesos y la existencia de determinados géneros o especies significativamente asociados con cada grupo[38], [39]. En nuestro estudio, además de observar cambios a nivel de filo, también se han encontrado diferencias en la proporción de determinados géneros bacterianos dentro de la microbiota de pacientes obesos con respecto a los individuos control, además de una riqueza bacteriana observada mayor en los pacientes obesos. Géneros como Blautia, Oscillospira, Flavobacterium, Alkaliphillus y Eubacterium fueron detectados en menor proporción de manera significativa en los pacientes obesos con respecto a los individuos control. Mientras que, por el contrario, los géneros Prevotella, Megasphaera, Lactobacillus, Meganomas y Acidaminococcus aparecían significativamente incrementados en pacientes obesos. La elevación de la concentración de bacterias pertenecientes al género Lactobacillus en pacientes obesos ya ha sido previamente descrita, lo que podría indicar un posible papel del género Lactobacillus sobre la ganancia de peso y la obesidad[40]-[42]. Otros géneros que también han mostrado resultados similares en distintos estudios y que podrían estar asociados a la patogénesis de la obesidad son Prevotella y Megamonas[39], [43]. Estos resultados demostrarían que no hay única bacteria implicada en la patogénesis de la obesidad, sino la existencia de una disbiosis intestinal. Sin embargo, una de las principales cuestiones que se plantean es si los cambios en la microbiota intestinal preceden al desarrollo de obesidad o si por el contrario son una consecuencia de dicho fenotipo. En este estudio, las comunidades de bacterias de los individuos control se agrupan de forma separada de las comunidades de pacientes obesos, lo cual determina a la obesidad como un factor importante en la agrupación de las comunidades de bacterias, justificando así la relación entre la composición de la microbiota intestinal y la obesidad.
En conclusión, estos resultados muestran una disbiosis intestinal, fundamentalmente observada a nivel de género, implicada en el desarrollo de obesidad, justificando así la importancia de la modulación de la microbiota intestinal como posible alternativa terapéutica para la prevención y el tratamiento de esta enfermedad.
Reconocimientos
Este trabajo ha sido financiado por los proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad/FEDER (BFU2013-48141-R), de las Consejerías de Sanidad (LEU35U13) y de Educación de la Junta de Castilla y León y Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) (LE063U16) y de la Gerencia Regional de Salud de la Junta de Castilla y León (GRS 1428/A/16). CIBERehd está financiado por el Instituto de Salud Carlos III. Esther Nistal, Maite Arias-Loste y Begoña Álvarez recibieron la Beca ACAD 2015 para la realización de dicho trabajo.